安全な生殖補助医療を行うためのHIVウイルス分離法の確立　研究班

長い間、医療者はHIV感染者の挙児希望に関して否定的な態度をとってきました。二次感染の危険性や予後に不安が強かったからです。しかし1996年にプロテアーゼ阻害剤（PI）を含む多剤併用療法が導入されて以来、HIV/AIDSはコントロール可能な慢性感染症になりつつあります。そのため、結婚して子供が欲しいと普通に願うHIV感染者が増えています。ただ、これまで子どもを作りたいと医師に相談をしても二次感染防止のためにコンドームの使用を言われ、断念することを勧められるだけでした。あきらめきれずに子供を作ろうとして妻が感染した例もあります。それだけでなく、抗HIV剤の催奇形性の問題も解決されてはいませんし、HIVに感染した乳幼児の予後は未だに不良です。

しかしHIV感染者の生殖補助医療は確実に進歩しており、今回、私たちはHIV感染者の精液からHIVを完全に除去し、体外受精を利用して母も子も感染させずに安全に妊娠できる方法を開発しました。ここではそれについてご紹介いたします。

※人工授精や体外受精の安全性は施設によって異なりますので、方法としてウイルス除去が不十分な場合、技術として不慣れな場合は、危険性がのこりますので注意すべきです。説明をよく読んで、不十分な技術による二次感染の危険性をよく理解してください。

ご存知のように精液にはHIVが混じっています。一口にHIVと言っても、自由に漂っているHIV（RNA）、精子に付着したHIV（RNA）、ウイルスを産生している単核球（proviral DNA）など、いろいろあります。感染力が最も強いのは感染細胞から作られるHIV (RNA)です。

Quinnらは血液中のウイルス量（viral loadと言います。VLと略記されます）が多いほど性交渉による二次感染の確率は高くなり、VLが400以下では二次感染が少ないと報告していますが、調査人数が少なくVLをどれだけ下げると大丈夫かは不明です。私たちの検討でも確かに血中VLと精液中VLには相関が認められ、抗HIV療法で血中VLが少なくなると精液中VLも少なくなって、性行為による二次感染率は低くなると思われます。しかし、正確な調査の実施は倫理的にできませんし、VLが検出限界以下なら感染は生じないと考えるのはとても危険なことと言えましょう。

一度の性行為による感染確率は、WHOによれば、0.1～1.0%と言われています。確率に10倍も幅があるのは、双方の身体状況や接触方法によって感染確率が異なるからです。一般的にHIV/AIDSが進行している場合は5/1000、安定している場合は0.7/1000前後となります。感染者の血中ウイルス量が多ければ確率は上がりますし、クラミジア感染症などの性感染症に罹患していると確率は4倍程度、はね上がるとの報告もあります。肛門性交の受身側は0.1～3.0%、経口で暴露した場合も歯周病、口腔内粘膜損傷や性病罹患によって感染危険性が高まることもあり、安心できません。

なお、HIV感染者の夫が、妻の妊娠を願って、排卵日だけコンドームを使用しない場合では、毎年約4.8％ずつの妻が感染していくと推測されます。1%の感染確率として毎週1回の危険性ある性行為を行えば感染確率は1年間で41%となります。

HIV陽性者の精液を何も処理をしないで用いた人工授精では約3.5％が二次感染しました。それに対して、イタリアのSempriniらは、Swim up法により精子を処理して2000回以上人工授精を行い、二次感染がないと報告しています。ただし、Sempriniらの方法は回収精子でHIV RNA（800copies/ml（つまり、799以下のウイルスがあってもわからない））でしか確認しておらず、ウイルス除去が本当に確実に行われているのか疑問がもたれてきました。

表1.HIV感染男性がHIV陰性女性と子どもを持つ場合の女性の二次感染確率

Swim up法も研究者によって方法が異なり、結果としてウイルス除去率も異なります。

私たちやフランスのグループなどは精液中のHIVを検出限界以下（50copies/ml）にできましたが、施設によっては部分的にしか検出限界以下（100copies/ml）にできない例もありました。その原因は、従来の不妊症で行われている方法を用いたためと思われ、はっきりとウイルス除去を目的とした方法を使わなければいけないことが、判明しています。私たちは改良Swim up法によって回収精子にHIVが1\copyもないことを確認しました。

1.精液希釈と夾雑物除去

精液には前立腺由来のムチン^*1やシュウ酸結晶^*2の他に、尿道通過時の雑菌や下着の繊維などが混入しています（前述図1参照）。そのまま遠心分離機にかけると夾雑物（ゴミ）と一緒にHIVを巻き込む危険性があります。

私たちは遠心前に精液を希釈し、静置してゴミを沈殿させた後に上層の精子浮遊液を回収し、フィルター濾過して遠心分離します。（図2参照）

*1

ムチンとは気管、胃腸などの消化管、生殖腺などの内腔を覆う粘液の主要な糖タンパク質

*2

シュウ酸結晶は尿の中に含まれているミネラル

2.HIV分離液と濃度設定の選択

HIV分離液は1層より2層より4層と層を増やせば、増やすほどウイルス除去率は高まりますが、精子の回収率が悪くなってしまいます。そこで私たちは98％パコールを用いた「連続密度勾配」法を開発して、ウイルス除去率を1/10⁶以下に高める同時に精子回収率も向上させることに成功しました。

3.遠心分離後の精子分画の回収法

遠心分離後、HIVは上層に分布し、単核球は中間層に分布し、健康な精子は底に沈んでいるわれですが、一番底の洗浄精子をどのように回収するかも問題です。つまり上から順に吸引して精子を回収すると管壁を伝わりHIVが混入する危険性があるのです。私たちは共同研究者の兼子先生が開発した特殊試験管を用いて上層成分を完全に遮断して底の精子を回収しています（図2）。

4.改良Swim up法

従来のSwim up法は精子の含まれる液（精子浮遊液）に精子だけが上がる性質を持つ液（培養液）を上部において（重層して）泳いで上ってくる精子を回収します。ただ、この方法では遠心後の精子を培養液で洗浄し、そこに培養液を重層すると比重差がなくなって、ウイルスが混じってしまう危険があります。私たちは98％パコール液の最下層の精子浮遊液（とても濃い液体）を底に静置し、上に薄い培養液を重層させて、泳いで上る精子を回収しています（図3）。

1.精子や卵へのHIVの感染と付着の可能性

HIVが精子や卵に感染するか否かも議論があります。精子表面に付着したHIVの定量報告はなく、Swim up法で回収した精子表面に、万々が一にもHIVが付着していないかが重大な問題でした。しかし、精子や卵は未分化細胞で、CD4などは未だ持っていません。卵は妊娠10週以後リンパ組織が分化してCD4蛋白が発現します。ということは体外受精の培養液に仮にウイルスが混入しても、卵細胞にウイルスが感染することはないと考えられます。

実際、受精卵や胎児に精液中のHIVが直接感染するとすれば、母に感染しないで胎児のみに感染する可能性がありますが、そのような報告は、これまで何千万人もの感染者の中で一件もなく、精子にHIVが付着して卵に感染する可能性はないと思われます。

参考：

培養液中でのHIVの感染力
HIVは毎日100億個産生されますが、感染力を持っているウイルスは全体の一万分の1以下と考えられます。さらに、HIVを培養液の中で培養すると、感染力は1日毎に1/10以下に低下することが、共同研究者である慶應の加藤先生たちの研究で判明しています。

2.体外受精と人工授精

人工授精は採取した精液を子宮内に注入して受精を狙うやり方で、体外受精は成熟した卵を母体から採取して、体の外で精液によって受精させるやり方です。体外受精は人工授精に比して二次感染防止の面では数段優れています。つまり、人工授精でHIVが混入した精子を子宮に注入した場合、子宮内の細胞に感染する危険性があります。体外受精で卵を取り出して精子と培養する時にHIVが万一にも混入していたとしても卵には感染せず、HIVの感染性は二日目には100分の1以下に低下します。さらに培養液を2日目に交換し、受精卵を洗浄すると、たとえ精子液にHIVが混入していても相当減少できます。

我々は胚移植前に培養液中のHIVが全くないことを超高感度PCR^*3で確認しています。しかし、体外受精は排卵誘発剤による過卵巣剰刺激症候群^*4など女性への負担が大きいのが欠点です。

*3

PCRは開発会社のロッシュ社の検査の名称。
血漿中のHIV RNA量を測る検査で、

• 病気の進行予測：多いほど早い
• 治療開始の時期の判断
• 耐性発生など治療変更の判断
• 抗HIV薬の効果判定
• 急性HIV感染症の診断

などの指標になります。50copy以下なら増殖は抑えられていると判断されています。但し、その手法上、ウイルスを何十万倍にも増幅させる検査なので誤差も大きく、2～3倍程度の差は誤差の可能性があります。ウイルスの有無をみる目的であれば、誤差に関わらずウイルスが見つかれば、感染成立していることになりますが、経過をみる上では複数回の検査で進行度合いを判断する必要があります。ここでは一般的に使用されているPCR検査よりはるかに検出感度の高い検査（1つのウイルスを検出できる）を使用しています。

*4

卵巣過剰刺激症候群（OHSS）はGnRHa+hMGによるIVF-ET周期の約6％に入院を必要とする症例が発症すると言われ、また一般のhMG+hCG療法においては約16％程度発症するといわれています。このOHSSは卵巣腫大をもたらすだけでなく、腹水貯留を引き起こし、その結果として血液濃縮が引き起こされ、この血液濃縮により腎不全や血栓症など生命予後にかかわる重大な合併症に進展することがあります。

3.HIV感染者の精子

HIV感染者の多くは、精子の数が減少し、奇形率も高く、運動率も低下しています。

Percoll法とSwim up法を組み合わせた場合、そうでなくても精子の回収率は低下しますから、HIV感染者では回収可能な精子は極めて少なくなります。そのために人工授精で妊娠する可能性が低いと思われました。二次感染の予防と受精率の向上、この二つを考えて、体外受精を採用したのです。なお、精子の異常がHIV感染によるのか、抗HIV剤の副作用によるのかは不明で今後検討していきたいと考えています。

4.顕微授精（ICSI）について

運動性の良い精子を1匹回収して卵細胞に注入する顕微授精（ICSI）の方法によっても二次感染無く、妊娠出産できています。精子の状態の悪い方にはこうした方法を適用することで、卵子に受精させることができます。

5.体外受精のプロトコール

実施予定の二週間前から実施施設において卵子採取のためのホルモン注射を行います。この期間病院に毎日通院することが必要となります。自宅から遠い場合は、宿泊も必要になります。地元の受け入れ医療機関の全面的な協力が得られれば、最初の一週間程度を受け入れ施設で注射できた例もあります。

採卵し、事前に洗浄し検査済の精子を使って体外受精を行います。採卵後に再度ウイルスが検出されないことを確認して、胚移植をおこないます。胚移植までは2～3日滞在ということになります。

実施後は選定した受け入れ医療機関で妊娠継続をする。

1.体外受精への参加条件について

1. 感染経路・セクシャリティは問いません（一部に製剤経由の方のみではという誤解もあるようです）が、陽性男性、陰性女性に限定されます。

   ※超高感度PCR検査でウイルスの有無を確認する過程でプライマーという物を使用します。このプライマーはウイルスのサブタイプによって異なる関係上、感染経路について個別にお尋ねする場合がありますので、ご了承ください。

2. 法定婚であること（現時点では研究事業の一部なので、原則として、別な倫理問題が派生しそうな関係は今回は除外しています→但し常識の範囲で実施される時点で婚姻関係が当然、成立すると予想される場合－結婚式が来月予定など－は、来院し、相談に応じることは可能）。
3. 夫婦双方の自発的な希望が、皆さんの時点で確認されていること（家の都合などの不本意な同意でないことを一応は確認してください）
4. その他、常識的な判断で、挙児希望に関して支障のある状況がないこと。

2.参加へのステップ

1. 上記事項の確認
2. 必須ではありませんが、主治医に紹介状を作成してもらう。服薬の有無や検査値等が分かれば、参考になります。もし女性の婦人科的な問題もチェックしてあれば、添付してください。なお女性のマイナスを最後に確認した時期も分かれば教えてください。
3. 遠方の場合はクライアントさんの都合も訊いてから、荻窪病院の花房医師か、小島カウンセラーに連絡を取り、当院の血液科に予約を入れる。TEL03-3399-1101
4. できれば夫婦で当院に来院してもらう。説明を聞くだけなら一人でかまいませんが、二人の意思確認が終わらないと次に進めません。
5. 当院では手技の説明を行う他、医師、カウンセラーや外来ナースが個別に意思確認を行います。
6. 説明を聞いて挙児希望が変わらない場合、直ちに妻の基礎体温の測定を開始すると同時にその旨を荻窪病院スタッフに伝え、実施施設決定とその施設への往訪日を調整してもらう
7. 精子の検査を実施施設（運動性と数の確認のみなら荻窪病院で行えます）で行います。

   ※感染、C型肝炎治療や抗HIV薬の影響で健常な精子数がきわめて少なかったり、運動性が悪かったり、場合によっては無精子症のこともあります。少ない場合、複数回の採取・洗浄・精子凍結を行うことも考えられます。

8. その結果が良好であれば、実施病院との話で開始時期を決定します。
9. 実際の体外受精実施の二週間前から実施施設において卵子採取のためのホルモン注射を行います。この期間病院に毎日通院することが必要となります。
10. そして実施。実施後はなるべく地元の医療機関で妊娠継続をしてもらうのが理想です。

    ※非感染の確認ために時々の採血協力をしていただきます。

1.夫陰性、妻陽性で挙児希望がある場合

当研究班では行っていませんが、国立国際医療センター、エイズ治療開発センターにて相談を受け付けておりますので、ご相談ください。

2.夫婦共にHIV陽性である場合

夫婦が共にHIVに感染し、子どもを望む場合、夫婦感染でも夫婦それぞれが感染しているHIVが同じとは限りません。異なるとすれば、重複感染が起きる危険性があります。重複感染すると飲んでいない薬に薬剤耐性になってしまうことが予想されます。ただ、残念ながら現在、夫の精液を洗浄することについては当研究班の対象の枠を外れていますので、参加できません。今後の議論を必要とします。

3.C型肝炎の問題

非加熱製剤を使用した血友病患者の90％以上がC型肝炎に感染し、HIV/HCV感染者の死因の一位はC型肝炎の悪化となっています。C型肝炎の治療としてIFN+ribavirin併用療法^*5が有効で、早期治療が勧告されています。しかし、リバビリンは精子の奇形を高率にもたらし、治療中と治療終了後半年は避妊が必要です。C型肝炎の治療を優先させるか、子供を優先させるかは主治医とよく相談し、場合によっては精子の冷凍保存の必要があります。Swim up法で精液中のHCVも除去される一方、体外受精でHCVが二次感染した報告もあり、不妊治療の中でのウイルス感染対策のガイドライン作成を求められています。

*5

IFN+ribavirin併用療法とは現在、C型肝炎の治療として行われている治療で、注射薬のIFN（インターフェロン）と飲み薬のribavirin（リバビリン）を併用する治療法で、催奇形性（奇形を促す要因）があるとされ、男性・女性共に使用禁忌となっています。

イタリア、フランス、スペイン、イギリスなどでは、HIV感染者の人工授精を積極的に行うようになりつつありますが、アメリカCDCは未だに禁止勧告を解除していません。我が国ではHIV感染者の人工授精の実施は倫理委員会の承認を得るように産婦人科学会が2003年1月に勧告を出しました。子どもをあきらめるか、自然な妊娠、ウイルス除去が不十分な人工授精、改良法による人工授精や体外受精、（表参照：スペースがなければ削除）どれを選択するかは医療従事者と患者夫婦が十分に相談すべきと思います。個々の精子の状態によって、人工授精、体外受精、顕微受精などの適用は異なりますが、超高感度PCRによるHIVの完全除去の確認がされれば、どの手技を選択してもよいと思います。